K599電轉感受態細胞

K599電轉感受態細胞

產品規格CAT#: BFNC86115-01(10×100ul)/BFNC86115-02(50×100ul)
K599 Electro：                                                             50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )：                 10μl
保存條件(保質期)：                                          -80℃（12個月）

基因型

Agrobacterium rhizogenes (str^R ) pRi2659 (agropine type)

產品說明

發根農桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細菌，它能夠感染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物以及個別裸子植物。K599發根農桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農桿堿型Ri質粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時具有鏈霉素抗性。

青旗生物生產的K599電轉感受態特別適用于大質粒的轉化，感受態細胞經特殊工藝制作，pCAMBIA2301質粒（卡那霉素抗性）檢測，轉化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經pCAMBIA2301-ZH質粒（size:40 kb）檢測轉化效率可達5×10³ cfu/μg DNA。

常規操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，盡量用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉化效率較高，*使用前盡量做預實驗確定所加質粒的量），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉槽中，啟動電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無抗生素的TY，并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天

K599電轉感受態細胞

● 農桿菌相關抗生素配方：

常用農桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

● TY配方（1L）：

Tryptone                5g

Yeast extract          3g

補水到1L體積，*溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌

配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌

每1L 滅菌的TY液體營養液中加入10ml 無菌的1M氯化鈣水溶液即可。

若配制TY固體培養基，則加入15g 瓊脂粉。

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

2. 電轉感受態細胞中不可混入氣泡，轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量或終用于涂板的菌量。

4. K599具有鏈霉素抗性，不可用于具有鏈霉素抗性質粒的轉化。